АвторЫ — А.Л. Усс, П.Б. Мицкевич, И.Л. Завгородняя
Республиканский центр гематологии и трансплантации костного мозга на базе 9-й клинической больницы г. Минска.
Статья Опубликована в журнале «Медицинская панорама» №2(27)2003,стр.38
Республиканский центр гематологии и трансплантации костного мозга на базе 9-й клинической больницы г. Минска.
Статья Опубликована в журнале «Медицинская панорама» №2(27)2003,стр.38
Криоконсервирование клеток человека
Проблема сохранения живых клеток вне организма человека, in vitro или ex vivo, является весьма актуальной для практической медицины. Так, например, в связи с расширением показаний к применению хирургических методов возросла потребность в постоянном наличии запасов полноценной крови и ее компонентов (эритро-, тромбо-, лейкоцитов). В результате широкого использования лучевой терапии и цитостатиков для лечения злокачественных опухолей и лейкозов возникла проблема купирования таких осложнений, как иммуно- и гемодепрессии путем трансплантации клеток крови или костного мозга. В последнее время интенсивно развивается и совсем новое направление - репродуктивная медицина, которая занимается искусственным оплодотворением на основе использования заранее выделенных из организма человека яйцеклеток и сперматозоидов, а также целых эмбрионов.
Однако необходимые для лечения индивидуума клетки не всегда можно быстро получить в «свежем» виде у подходящего донора. С другой стороны, клетки, выделенные заранее, быстро погибают вне организма при обычной температуре. Вот почему возникла проблема длительного хранения отдельных типов клеток человека, или их консервации.
Под консервацией в данном случае следует понимать сохранение биообъекта или его определенных свойств в искусственных условиях в течение определенного промежутка времени. Наиболее подходящим для этих целей оказался метод криоконсервации. Это комплекс мероприятий, обеспечивающих хранение биологических объектов при низких температурах в жизнеспособном состоянии. Изучением состояния биологических объектов в диапазонах температур ниже тех, к которым они адаптированы, занимается криобиология.
Для длительной криоконсервации клетки замораживают до температуры -80 °С или ниже. Необходимость использования сверхнизких температур связана с тем, что только при таких условиях в клетках практически полностью прекращаются все биохимические процессы. Так, при температуре 0 °С время жизни клеток весьма ограничено. При этом происходят следующие патофизиологические процессы:
1. «Выключение Na-насоса» и как следствие - набухание клеток.
2. Изменение фазового состояния липидов клеточных мембран и нарушение активности мембраносвязанных ферментов.
3. Преципитация слаборастворимых компонентов, изменение констант диссоциации некоторых веществ и, следовательно, рН растворов.
4. И наконец, по неустановленным еще причинам, быстрое охлаждение может привести к гибели клетки как таковой. Этот феномен назван термическим, или холодовым, шоком.
На практике установлено, что длительно сохранить клетки человека пока удается только в виде замороженной суспензии при температуре -80 °С или ниже. Сам процесс замораживания и последующего размораживания может оказать на клетку еще более губительное воздействие, чем просто охлаждение до 0 °С. Чтобы разрешить эту проблему, были изучены механизмы отрицательного влияния замораживания-размораживания и разработаны способы, позволяющие свести к минимуму повреждающие эффекты.
Физиологические основы криоконсервирования клеток
В процессе замораживания клеток необходимо выделить следующие методические этапы:
1. Приготовление клеточных суспензий (например, выделение необходимых клеток крови, сперматозоидов, яйцеклеток).
2. Подготовка клеточных суспензий к консервации (например, добавление криопротекторов).
3. Собственно замораживание.
4. Хранение криоконсервированных клеток в специальных емкостях при определенных температурах.
По диапазонам температур выделяют следующие этапы криоконсервации клеток.
1. От -37 до -25 °С - зона температурного оптимума биологической активности.
2. От -25 до -10 °С - зона перехода клеток в состояние неполного анабиоза (временное прекращение или торможение метаболических процессов, «переохлаждение» клеточных суспензий без кристаллизации воды).
3. От -10 до -80 °С - зона кристаллизации охлажденной и переохлажденной окружающей клетку и внутриклеточной воды и перехода клетки в состояние полного анабиоза.
4. От -80 до -130 °С - зона кристаллизации связанной и адсорбированной воды и рекристаллизации.
5. От -130 до -273 °С - зона отсутствия кристаллизации и рекристаллизации.
Итак, суспензия клеток в изотоническом растворе солей (например, физиологическом) должна начать замерзать при -0,6 °С - температуре замерзания данного раствора. Однако замерзание суспензии обычно начинается с кристаллизации т.н. внеклеточной (расположенной между клетками) воды только при понижении температуры до -10 °С, при которой и происходит формирование «очагов» кристаллизации воды. При этом клеточная суспензия в диапазоне температур от 0 до -10 °С является переохлажденной, т.е. находящейся в метастабильном, жидком состоянии. Замерзание внутриклеточной жидкости обычно начинается при температуре около -40 °С.
На этапах замораживания клеточных суспензий повреждение клеток могут вызвать следующие факторы:
1. Скорость замораживания. Следует отметить, что для каждого типа клеток существует своя, оптимальная скорость замораживания, которая определяется экспериментальным путем. Если суспензия клеток замораживается слишком быстро, то сначала образуются внутриклеточные кристаллы льда, которые разрывают клеточные органеллы и мембрану, приводя к лизису и гибели клеток после их размораживания. Наоборот, если клетки замораживать слишком медленно, сначала происходит замораживание внеклеточной воды, что приводит к образованию гиперконцентрированных растворов солей и изменению рН среды. Все это вызывает т.н. обезвоживание клеток и впоследствии их гибель.
2. Перегрев клеток при замораживании наблюдается в результате выделения тепла в момент фазового перехода жидкой внеклеточной воды в лед. Такой перегрев также может привести к необратимому повреждению клеток. Для его предотвращения в ряде случаев применяют программное, или контролируемое замораживание, когда в момент фазового перехода вода/лед суспензию клеток стараются кратковременно охлаждать очень быстро, что нейтрализует перегрев клеток.
3. Холодовой шок, о котором упоминалось выше.
Криопротекторы
Несмотря на перечисленные выше проблемы, в настоящее время удается заморозить и затем разморозить суспензии клеток, сохранив при этом их жизнеспособность. Этого можно добиться благодаря одновременному использованию двух подходов:
1. Применение т.н. криопротекторов - веществ, которые обладают способностью предупреждать развитие криоповреждений и обеспечивать сохранность клеток в жизнеспособном состоянии после замораживания и размораживания.
2. Охлаждение с определенной, оптимальной для данного типа клеток скоростью.
Криопротекторы разделяют на быстро проникающие в клетку низкомолекулярные вещества (диметилсульфоксид), медленно проникающие (глицерин) и непроникающие высокомолекулярные вещества (полиэтиленоксид). Общим механизмом действия криопротекторов является их способность связывать молекулы воды, что замедляет рост кристаллов льда. Это предупреждает быстрое нарастание концентрации солей во внеклеточной среде и повреждение клеток в результате осмотического шока.
Методы замораживания клеток и их хранение
Применяют два основных метода замораживания:
1. Неконтролируемое, или ручное замораживание, когда сосуд с суспензией клеток в смеси с криопротектором помещают в морозильную камеру (-80 °С) или в пары жидкого азота (-130°С) - замораживание происходит со скоростью примерно 1-3 °С в мин;
2. Контролируемое, или программное замораживание, при котором клеточные суспензии охлаждают с помощью специальных приборов - программных замораживателей.
Такой способ позволяет достичь наилучших результатов. Замороженные клетки хранят в электрических морозильных камерах при температуре от -80 до -130 °С или в сосудах Дьюара : жидким азотом при температуре -196 °С. Чем ниже температура в хранилище, тем дольше можно сохранить жизнеспособные клетки. Хотя при температуре ниже -150 °С существенной разницы уже не наблюдается, так как метаболические и кристаллизационные процессы в клетках не происходят.
Размораживание клеток
Необходимо для восстановления функциональной активности клеток после хранения. В физическом смысле под размораживанием понимают повышение температуры биологических объектов, сопровождающееся фазовым переходом льда в жидкое состояние. На этом этапе клетки могут быть необратимо повреждены в результате двух процессов:
1. Рекристаллизации льда - образования больших кристаллов из мелких и повреждения последними клеточных структур.
2. Гипотонического шока - резкого снижения осмолярности внеклеточной жидкости в результате быстрого плавления внеклеточного льда.
Для предотвращения этих феноменов на практике применяют несколько методов размораживания:
1. Нагрев теплопередачей - путем быстрого погружения сосудов с замороженными клетками в воду температурой около +40 °С.
2. Нагрев в сверхвысокочастотном (СВЧ) электромагнитном поле.
3. Размораживание теплопередачей с воздействием давления. В клинической медицине, как правило, ограничиваются наиболее простым способом - размораживанием в водяной бане.
Однако существенным моментом является предотвращение токсического действия криопротекторов после размораживания (особенно токсичен для клеток диметилсульфоксид).
Для этого обычно применяют два способа:
1. Размороженные клетки отмывают от криопротекторов in vitro путем постепенного добавления изотонического раствора, содержащего 10-20% сыворотки или альбумина, что смягчает эффекты изменения осмотического давления.
2. Свежеразмороженную клеточную суспензию быстро вводят внутривенно пациенту вместе с криопротектором, при этом плазма крови нейтрализует осмотическое и токсическое повреждение размороженных клеток (например, при трансплантации размороженного костного мозга).
Важным моментом является контроль жизнеспособности замороженных и размороженных клеток.
С этой целью используют два основных подхода:
1. Морфологическая оценка жизнеспособности, например, по исключению красителя трипанового синего (не проникает через неповрежденную мембрану и не окрашивает клетки).
2. Исследование функциональной активности размороженных клеток (выбор теста зависит от их типа - в случае кроветворных клеток это может быть изучение способности образования ими колоний в агаре под действием колониестимулирующих факторов; в случае сперматозоидов - оценка их подвижности и т.п.).
Криоконсервирование кроветворных клеток
Трансплантацию кроветворных клеток человека используют для восстановления гемопоэза у больных после воздействия цитостатических противоопухолевых препаратов или тотального облучения тела. У таких пациентов наблюдается полное исчезновение собственных клеток крови, и без пересадки кроветворных клеток они умирают от инфекций. Забор костного мозга или периферических стволовых клеток крови производят до начала интенсивной химиотерапии или облучения (курс продолжается до 1-й недели или более), а затем клетки переливают (трансплантируют) для восстановления гемопоэза. Для лечения некоторых заболеваний используют также аллогенные кроветворные клетки от HLA-совместимого здорового донора. Однако до трансплантации гемопоэтические клетки необходимо сохранять в жизнеспособном состоянии. Это можно сделать путем их замораживания с последующим размораживанием. В настоящее время для восстановления кроветворения используют клетки костного мозга, стволовые клетки периферической крови, клетки крови пупочного канатика новорожденных; разрабатываются подходы к трансплантации клеток эмбриональной печени.
Все типы кроветворных клеток могут быть подвергнуты криоконсервированию с последующим успешным размораживанием и восстановлением функциональной активности. Как правило, замораживают суспензию клеток в аутологичной плазме или сыворотке в присутствии криопротектора (обычно используют 10%-й диметилсульфоксид). Замороженные таким образом кроветворные клетки сохраняют жизнеспособность после хранения в течение 1-го года и более. Перед трансплантацией клетки быстро размораживают, и вводят суспензию внутривенно без отмывки от криопротектора.
Криоконсервирование зрелых клеток крови
Криоконсервирование эритро-, лейко-, тромбоцитов в последнее время применяется все реже. Это связано с большей терапевтической эффективностью свежевыделенных клеток (особенно тромбоцитов), сужением показаний к переливанию лейкоцитов в целом, а также с внедрением автоматических сепараторов клеток крови, которые позволяют получать большое количество свежих донорских клеток в необходимое время.
Однако на данном примере можно отметить различие в подходах к криоконсервации тех или иных типов клеток. Так, для эритроцитов в отличие от кроветворных клеток наиболее подходящими криопротекторами являются глицерин или полиэтиленоксид.
При этом оптимальная скорость замораживания эритроцитов составляет примерно 1000 °С в мин. Поэтому эритроциты помещают в т. н. замораживающий или ограждающий раствор с 30%-м глицерином и после инкубации при комнатной температуре в течение 20 мин для полной «глицеринизации» (проникновения криопротектора в клетки) погружают в специальных контейнерах непосредственно в жидкий азот. Такой подход неприемлем для замораживания ядросодержащих лейкоцитов или тромбоцитов, которые требуют постепенного, медленного охлаждения. В целом методики замораживания этих клеток сходны с технологией криоконсервации кроветворных клеток.
Криоконсервирование половых клеток
Относительно новым и весьма актуальным направлением в репродуктивной медицине является криоконсервирование сперматозоидов и яйцеклеток человека. Замораживание сперматозоидов уже практически стало рутинной процедурой в ряде зарубежных центров. Созданы специальные «банки» половых клеток, которые содержат материал, применяемый для искусственного оплодотворения. Важным аспектом является криоконсервирование спермы онкологических больных. Это дает им шанс иметь нормальное потомство после курса химиотерапии или облучения, в результате которых пациенты часто становятся бесплодными. Замораживание сперматозоидов производят с использованием режима, сходного с криоконсервацией кроветворных клеток. Однако в качестве криопротектора обычно применяют специфическую смесь на основе глицерина и желтка куриных яиц.
Что касается замораживания яйцеклеток, то эта процедура, практически вполне осуществимая, пока не вошла в обычную клиническую практику и находится на стадии разработки. Однако особенно перспективным представляется успешное замораживание и размораживание жизнеспособных эмбрионов человека (полученных, правда, на очень ранней стадии).
Заключение
В настоящее время проводятся экспериментальные испытания по трансплантации замороженных и размороженных живых тканей, таких как эндокринные железы, легочная ткань, ткани сердечной мышцы и др. В ряде центров интенсивно разрабатываются новые криопротекторы, которые в отличие от существующих не обладали бы токсическим действием на клетки. Теоретическая возможность создания таких веществ, а также постоянное совершенствование технологии замораживания позволяют надеяться, что в недалеком будущем медицина вплотную подойдет к решению проблемы криоконсервации отдельных органов.
Однако необходимые для лечения индивидуума клетки не всегда можно быстро получить в «свежем» виде у подходящего донора. С другой стороны, клетки, выделенные заранее, быстро погибают вне организма при обычной температуре. Вот почему возникла проблема длительного хранения отдельных типов клеток человека, или их консервации.
Под консервацией в данном случае следует понимать сохранение биообъекта или его определенных свойств в искусственных условиях в течение определенного промежутка времени. Наиболее подходящим для этих целей оказался метод криоконсервации. Это комплекс мероприятий, обеспечивающих хранение биологических объектов при низких температурах в жизнеспособном состоянии. Изучением состояния биологических объектов в диапазонах температур ниже тех, к которым они адаптированы, занимается криобиология.
Для длительной криоконсервации клетки замораживают до температуры -80 °С или ниже. Необходимость использования сверхнизких температур связана с тем, что только при таких условиях в клетках практически полностью прекращаются все биохимические процессы. Так, при температуре 0 °С время жизни клеток весьма ограничено. При этом происходят следующие патофизиологические процессы:
1. «Выключение Na-насоса» и как следствие - набухание клеток.
2. Изменение фазового состояния липидов клеточных мембран и нарушение активности мембраносвязанных ферментов.
3. Преципитация слаборастворимых компонентов, изменение констант диссоциации некоторых веществ и, следовательно, рН растворов.
4. И наконец, по неустановленным еще причинам, быстрое охлаждение может привести к гибели клетки как таковой. Этот феномен назван термическим, или холодовым, шоком.
На практике установлено, что длительно сохранить клетки человека пока удается только в виде замороженной суспензии при температуре -80 °С или ниже. Сам процесс замораживания и последующего размораживания может оказать на клетку еще более губительное воздействие, чем просто охлаждение до 0 °С. Чтобы разрешить эту проблему, были изучены механизмы отрицательного влияния замораживания-размораживания и разработаны способы, позволяющие свести к минимуму повреждающие эффекты.
Физиологические основы криоконсервирования клеток
В процессе замораживания клеток необходимо выделить следующие методические этапы:
1. Приготовление клеточных суспензий (например, выделение необходимых клеток крови, сперматозоидов, яйцеклеток).
2. Подготовка клеточных суспензий к консервации (например, добавление криопротекторов).
3. Собственно замораживание.
4. Хранение криоконсервированных клеток в специальных емкостях при определенных температурах.
По диапазонам температур выделяют следующие этапы криоконсервации клеток.
1. От -37 до -25 °С - зона температурного оптимума биологической активности.
2. От -25 до -10 °С - зона перехода клеток в состояние неполного анабиоза (временное прекращение или торможение метаболических процессов, «переохлаждение» клеточных суспензий без кристаллизации воды).
3. От -10 до -80 °С - зона кристаллизации охлажденной и переохлажденной окружающей клетку и внутриклеточной воды и перехода клетки в состояние полного анабиоза.
4. От -80 до -130 °С - зона кристаллизации связанной и адсорбированной воды и рекристаллизации.
5. От -130 до -273 °С - зона отсутствия кристаллизации и рекристаллизации.
Итак, суспензия клеток в изотоническом растворе солей (например, физиологическом) должна начать замерзать при -0,6 °С - температуре замерзания данного раствора. Однако замерзание суспензии обычно начинается с кристаллизации т.н. внеклеточной (расположенной между клетками) воды только при понижении температуры до -10 °С, при которой и происходит формирование «очагов» кристаллизации воды. При этом клеточная суспензия в диапазоне температур от 0 до -10 °С является переохлажденной, т.е. находящейся в метастабильном, жидком состоянии. Замерзание внутриклеточной жидкости обычно начинается при температуре около -40 °С.
На этапах замораживания клеточных суспензий повреждение клеток могут вызвать следующие факторы:
1. Скорость замораживания. Следует отметить, что для каждого типа клеток существует своя, оптимальная скорость замораживания, которая определяется экспериментальным путем. Если суспензия клеток замораживается слишком быстро, то сначала образуются внутриклеточные кристаллы льда, которые разрывают клеточные органеллы и мембрану, приводя к лизису и гибели клеток после их размораживания. Наоборот, если клетки замораживать слишком медленно, сначала происходит замораживание внеклеточной воды, что приводит к образованию гиперконцентрированных растворов солей и изменению рН среды. Все это вызывает т.н. обезвоживание клеток и впоследствии их гибель.
2. Перегрев клеток при замораживании наблюдается в результате выделения тепла в момент фазового перехода жидкой внеклеточной воды в лед. Такой перегрев также может привести к необратимому повреждению клеток. Для его предотвращения в ряде случаев применяют программное, или контролируемое замораживание, когда в момент фазового перехода вода/лед суспензию клеток стараются кратковременно охлаждать очень быстро, что нейтрализует перегрев клеток.
3. Холодовой шок, о котором упоминалось выше.
Криопротекторы
Несмотря на перечисленные выше проблемы, в настоящее время удается заморозить и затем разморозить суспензии клеток, сохранив при этом их жизнеспособность. Этого можно добиться благодаря одновременному использованию двух подходов:
1. Применение т.н. криопротекторов - веществ, которые обладают способностью предупреждать развитие криоповреждений и обеспечивать сохранность клеток в жизнеспособном состоянии после замораживания и размораживания.
2. Охлаждение с определенной, оптимальной для данного типа клеток скоростью.
Криопротекторы разделяют на быстро проникающие в клетку низкомолекулярные вещества (диметилсульфоксид), медленно проникающие (глицерин) и непроникающие высокомолекулярные вещества (полиэтиленоксид). Общим механизмом действия криопротекторов является их способность связывать молекулы воды, что замедляет рост кристаллов льда. Это предупреждает быстрое нарастание концентрации солей во внеклеточной среде и повреждение клеток в результате осмотического шока.
Методы замораживания клеток и их хранение
Применяют два основных метода замораживания:
1. Неконтролируемое, или ручное замораживание, когда сосуд с суспензией клеток в смеси с криопротектором помещают в морозильную камеру (-80 °С) или в пары жидкого азота (-130°С) - замораживание происходит со скоростью примерно 1-3 °С в мин;
2. Контролируемое, или программное замораживание, при котором клеточные суспензии охлаждают с помощью специальных приборов - программных замораживателей.
Такой способ позволяет достичь наилучших результатов. Замороженные клетки хранят в электрических морозильных камерах при температуре от -80 до -130 °С или в сосудах Дьюара : жидким азотом при температуре -196 °С. Чем ниже температура в хранилище, тем дольше можно сохранить жизнеспособные клетки. Хотя при температуре ниже -150 °С существенной разницы уже не наблюдается, так как метаболические и кристаллизационные процессы в клетках не происходят.
Размораживание клеток
Необходимо для восстановления функциональной активности клеток после хранения. В физическом смысле под размораживанием понимают повышение температуры биологических объектов, сопровождающееся фазовым переходом льда в жидкое состояние. На этом этапе клетки могут быть необратимо повреждены в результате двух процессов:
1. Рекристаллизации льда - образования больших кристаллов из мелких и повреждения последними клеточных структур.
2. Гипотонического шока - резкого снижения осмолярности внеклеточной жидкости в результате быстрого плавления внеклеточного льда.
Для предотвращения этих феноменов на практике применяют несколько методов размораживания:
1. Нагрев теплопередачей - путем быстрого погружения сосудов с замороженными клетками в воду температурой около +40 °С.
2. Нагрев в сверхвысокочастотном (СВЧ) электромагнитном поле.
3. Размораживание теплопередачей с воздействием давления. В клинической медицине, как правило, ограничиваются наиболее простым способом - размораживанием в водяной бане.
Однако существенным моментом является предотвращение токсического действия криопротекторов после размораживания (особенно токсичен для клеток диметилсульфоксид).
Для этого обычно применяют два способа:
1. Размороженные клетки отмывают от криопротекторов in vitro путем постепенного добавления изотонического раствора, содержащего 10-20% сыворотки или альбумина, что смягчает эффекты изменения осмотического давления.
2. Свежеразмороженную клеточную суспензию быстро вводят внутривенно пациенту вместе с криопротектором, при этом плазма крови нейтрализует осмотическое и токсическое повреждение размороженных клеток (например, при трансплантации размороженного костного мозга).
Важным моментом является контроль жизнеспособности замороженных и размороженных клеток.
С этой целью используют два основных подхода:
1. Морфологическая оценка жизнеспособности, например, по исключению красителя трипанового синего (не проникает через неповрежденную мембрану и не окрашивает клетки).
2. Исследование функциональной активности размороженных клеток (выбор теста зависит от их типа - в случае кроветворных клеток это может быть изучение способности образования ими колоний в агаре под действием колониестимулирующих факторов; в случае сперматозоидов - оценка их подвижности и т.п.).
Криоконсервирование кроветворных клеток
Трансплантацию кроветворных клеток человека используют для восстановления гемопоэза у больных после воздействия цитостатических противоопухолевых препаратов или тотального облучения тела. У таких пациентов наблюдается полное исчезновение собственных клеток крови, и без пересадки кроветворных клеток они умирают от инфекций. Забор костного мозга или периферических стволовых клеток крови производят до начала интенсивной химиотерапии или облучения (курс продолжается до 1-й недели или более), а затем клетки переливают (трансплантируют) для восстановления гемопоэза. Для лечения некоторых заболеваний используют также аллогенные кроветворные клетки от HLA-совместимого здорового донора. Однако до трансплантации гемопоэтические клетки необходимо сохранять в жизнеспособном состоянии. Это можно сделать путем их замораживания с последующим размораживанием. В настоящее время для восстановления кроветворения используют клетки костного мозга, стволовые клетки периферической крови, клетки крови пупочного канатика новорожденных; разрабатываются подходы к трансплантации клеток эмбриональной печени.
Все типы кроветворных клеток могут быть подвергнуты криоконсервированию с последующим успешным размораживанием и восстановлением функциональной активности. Как правило, замораживают суспензию клеток в аутологичной плазме или сыворотке в присутствии криопротектора (обычно используют 10%-й диметилсульфоксид). Замороженные таким образом кроветворные клетки сохраняют жизнеспособность после хранения в течение 1-го года и более. Перед трансплантацией клетки быстро размораживают, и вводят суспензию внутривенно без отмывки от криопротектора.
Криоконсервирование зрелых клеток крови
Криоконсервирование эритро-, лейко-, тромбоцитов в последнее время применяется все реже. Это связано с большей терапевтической эффективностью свежевыделенных клеток (особенно тромбоцитов), сужением показаний к переливанию лейкоцитов в целом, а также с внедрением автоматических сепараторов клеток крови, которые позволяют получать большое количество свежих донорских клеток в необходимое время.
Однако на данном примере можно отметить различие в подходах к криоконсервации тех или иных типов клеток. Так, для эритроцитов в отличие от кроветворных клеток наиболее подходящими криопротекторами являются глицерин или полиэтиленоксид.
При этом оптимальная скорость замораживания эритроцитов составляет примерно 1000 °С в мин. Поэтому эритроциты помещают в т. н. замораживающий или ограждающий раствор с 30%-м глицерином и после инкубации при комнатной температуре в течение 20 мин для полной «глицеринизации» (проникновения криопротектора в клетки) погружают в специальных контейнерах непосредственно в жидкий азот. Такой подход неприемлем для замораживания ядросодержащих лейкоцитов или тромбоцитов, которые требуют постепенного, медленного охлаждения. В целом методики замораживания этих клеток сходны с технологией криоконсервации кроветворных клеток.
Криоконсервирование половых клеток
Относительно новым и весьма актуальным направлением в репродуктивной медицине является криоконсервирование сперматозоидов и яйцеклеток человека. Замораживание сперматозоидов уже практически стало рутинной процедурой в ряде зарубежных центров. Созданы специальные «банки» половых клеток, которые содержат материал, применяемый для искусственного оплодотворения. Важным аспектом является криоконсервирование спермы онкологических больных. Это дает им шанс иметь нормальное потомство после курса химиотерапии или облучения, в результате которых пациенты часто становятся бесплодными. Замораживание сперматозоидов производят с использованием режима, сходного с криоконсервацией кроветворных клеток. Однако в качестве криопротектора обычно применяют специфическую смесь на основе глицерина и желтка куриных яиц.
Что касается замораживания яйцеклеток, то эта процедура, практически вполне осуществимая, пока не вошла в обычную клиническую практику и находится на стадии разработки. Однако особенно перспективным представляется успешное замораживание и размораживание жизнеспособных эмбрионов человека (полученных, правда, на очень ранней стадии).
Заключение
В настоящее время проводятся экспериментальные испытания по трансплантации замороженных и размороженных живых тканей, таких как эндокринные железы, легочная ткань, ткани сердечной мышцы и др. В ряде центров интенсивно разрабатываются новые криопротекторы, которые в отличие от существующих не обладали бы токсическим действием на клетки. Теоретическая возможность создания таких веществ, а также постоянное совершенствование технологии замораживания позволяют надеяться, что в недалеком будущем медицина вплотную подойдет к решению проблемы криоконсервации отдельных органов.
