Автор — В. А.ЗМАЧИНСКИЙ, А.Л. УСС (БелМАПО).
Статья Опубликована в журнале «Медицинская панорама» №2 (27), СТР. 32, март 2003
Статья Опубликована в журнале «Медицинская панорама» №2 (27), СТР. 32, март 2003
Биология и клиническое применение стволовых клеток крови
Cтволовая клетка взрослого человека в последние годы привлекает все большее внимание исследователей. Имеются достоверные данные, что мультипотентные стволовые клетки костного мозга (КМ) могут трансформироваться в клетки различных типов тканей, поэтому они являются альтернативой стволовым эмбриональным клеткам. Активно изучается роль мультипотентных стволовых клеток КМ при лечении болезней печени, сердца и нейродегенеративных нарушений. В настоящее время при трансплантации все чаще применяются стволовые клетки крови (СКК).
Тем не менее все еще остается много неясных вопросов, касающихся их биологии и клинического использования. Механизм мобилизации гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) до сих пор неизвестен, вследствие чего дизайн мобилизационных протоколов является эмпирическим [1, 2]. Не определено влияние количественного и качественного состава клеток на восстановление гемопоэза после трансплантации СКК [3, 4, 5]. Все это вызывает необходимость проведения дальнейших исследований в этой области.
Ранее существовало положение о преимуществе КМ в качестве источника ГСК [6]. У человека в постнатальный период при обычных условиях в периферической крови содержится небольшое количество ГСК, их уровень возрастает при миелопролиферативных заболеваниях [7, 8, 9]. Первые попытки клинического применения немобилизованных клеток крови в качестве источника регенерации гемопоэза в конце 70-х гг. были неудачными [10, 11]. Более поздние работы также не выявили преимуществ в скорости восстановления кроветворения по сравнению с КМ [12, 13]. В дальнейшем внимание исследователей было сосредоточено на мобилизованных клетках крови. Было показано, что повышение уровня предшественников гемопоэза в крови может быть вызвано введением декстранов, эндотоксина, адренокортикотропина, а также физическими упражнениями [14, 15]. Благодаря преимуществам мобилизованных клеток крови в восстановлении гемопоэза в настоящее время только они используются с целью трансплантации [16,17,18].
Феномен мобилизации предшественников кроветворения
В настоящее время не вызывает сомнений, что мобилизованные предшественники кроветворения имеют костно-мозговое происхождение. Исходя из этого предполагается, что при мобилизации происходят следующие события: 1) модуляция взаимодействия предшественник - костно-мозговая строма; 2) миграция ГСК из костно-мозговых синусов сквозь базальную мембрану и эндотелиальный слой.
Локализация гемопоэза в КМ предполагает регуляцию адгезивных взаимодействий между примитивными кроветворными предшественниками и стромальным костно-мозговым микроокружением [19, 20, 21, 22]. Примитивные кроветворные предшественники имеют широкий спектр молекул клеточной адгезии (САМ - cell adhesion molecules), включая интегрины, селектины, иммуноглобулины и семейство CD44 адгезивных молекул. Лиганды ко многим САМ экспрессируются костно-мозговыми стромальными клетками [19, 21, 22]. Механизм регуляции взаимодействия между парами САМ - лиганд в КМ до конца не изучен. Однако недавние исследования показали возможную взаимосвязь между β1-интегрином VLA-4 и двумя лигандами - фибронектином и VCAM-1, экспрессируемыми костно-мозговой стромой [23, 24, 25, 26]. Продемонстрировано, что aнтиVLA-4-антитела, нарушая функционирование VLA-4, индуцируют мобилизацию гемопоэтических предшественников. Антитела к β2-интегрину (CD18), который также экспрессируется предшественниками кроветворения, нарушают процесс мобилизации, что доказывает роль VLA-4 в связывании предшественников с КМ [27]. Установлено, что мобилизованные СD34+-клетки демонстрируют редукцию экспрессии определенных САМ, в частности VLA-4, LFA-1, LFA-3, тогда как CD31, CD44, CD62L остаются интактными [28, 29]. Важно отметить, что функциональные сдвиги САМ могут происходить без изменения их поверхностной экспрессии. В обычных условиях зрелые лейкоциты, СD34+-клетки КМ экспрессируют β1-интегрины VLA-4 и VLA-5 в неактивном состоянии [30]. После лечения различными цитокинами, включая интерлейкин-3 (ИЛ-3), гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ), стволовый фактор (СФ), в СD34+-клетках зарегистрировано транзиторное (в пределах 10-15 мин) дозо¬зависимое повышение активности VLA-4 и VLA-5-лигандов [31, 32]. Из других важных результатов следует отметить снижение экспрессии c-kit, чьим лигандом является СФ, в мобилизованных СD34+-клетках периферической крови [1,2]. Механизм, ответствен¬ный за снижение экспрессии c-kit, остается неизвестным.
Полученные к настоящему времени данные позволяют предположить, что мобилизация кроветворных предшественников (возможно, частично) является результатом цитокининдуцированных изменений в функции интегринов на СD34+-клетках, что способствует их выходу из КМ. Факторы, модулирующие миграцию гемопоэтических предшественников из КМ, также не установлены. Хотя механизмы миграции нейтрофилов в ткани хорошо известны, остается неясным, принимают ли они участие в миграции кроветворных предшественников.
Большинство проведенных исследований сфокусировано на оценке свойств предшественников гемопоэза при их мобилизации. Только небольшая часть работ посвящена изучению стромы КМ в период мобилизации. Показано, что ее повреждение в результате предшествующей химиотерапии (XT) может объяснить неудовлетворительный эффект мобилизации [33]. Кроме того, было отмечено, что усиление пролиферации клеток стромы, наблюдаемое у больных, получающих ИЛ-3, может также привести к задержке выхода кроветворных предшественников из КМ [33].
Таким образом, механизмы мобилизации гемопоэтических предшественников из КМ в настоящее время недостаточно изучены. Большему пониманию этой проблемы, по мнению многих авторов, способствует появление данных, полученных в результате применения мобилизационных протоколов.
Протоколы мобилизации кроветворных предшественников.
Миелосупрессивная терапия.
Высокодозный циклофосфамид был первым мобилизационным протоколом, испытанным в клинических условиях [34, 35, 36]. При восстановлении гемопоэза после миелосупрессии в периферической крови было зафиксировано более чем 50-кратное повышение концентрации КОЕ-ГМ (гранулоцитарно-макрофагальной колониеобразующей единицы). Основными осложнениями при данном виде мобилизации являются сепсис и геморрагический синдром. В ряде клинических исследований показано, что при нейтропении после мобилизации сепсис отмечен у 44-100% больных; геморрагический синдром, требующий трансфузии тромбоконцентрата, - у 18%. Летальность в этот период составила 3% [36, 37, 38]. С появлением колониестимулирующих факторов миелосупрессивная мобилизация без них не проводится.
Миелосупрессивная терапия + гемопоэтические ростовые факторы
Применение гемопоэтических ростовых факторов (ГРФ) позволило значительно снизить токсичность и повысить эффективность протокола. В настоящее время с целью мобилизации предшественников кроветворения назначаются Г-КСФ, ГМ-КСФ, ИЛ-3, из которых в режимах миелосупрессии наиболее широко используется Г-КСФ. Среди схем мобилизации, включающих ГРФ, наиболее изучены следующие: высокодозный циклофосфамид (ВДЦ), ВДЦ+этопозид, ВДЦ+цисплатин [39]. Ряд авторов показал, что добавление Г-КСФ к ВДЦ позволяет вдвое увеличить содержание мононуклеаров в собранном лейкоконцентрате и в 4-6 раз повысить уровень СD34+-клеток. Доза Г-КСФ при мобилизации ГСК составляет, как правило, от 3 до б мкг/кг/сут. Однако на практике наиболее часто используют 300 мкг Г-КСФ в сутки. КСФ начинают вводить, как правило, на следующий день после окончания миелосупрессивной терапии. Имеются сообщения о применении Г-КСФ в дозе 300 мкг/сут на + 5 день после завершения курса ВДЦ [40].
ГМ-КСФ имеет мобилизационную активность, сравнимую с таковой Г-КСФ, однако менее распространен из-за побочных действий, главным из которых является лихорадка. Доза препарата составляет от 5 до 250 мкг/кг/сут. Введение ГМ-КСФ с +5 дня после миелосупрессивной терапии также эффективно, как и с +1 дня. Протокол с последовательным назначением ИЛ-3 и ГМ-КСФ позволяет собирать большее количество СКК [41]. Схема введения следующая: ИЛ-3 (дни от 1 до 5-го) и ГМ-КСФ (дни от б до 14-го); оба в дозе 250 мкг/м2/сут.
Как показали рандомизированные исследования, наибольший мобилизационный эффект получен при использовании PIXY321 (ГМ-КСФ/ИЛ-3 объединенный белок) в дозе от 500 до 1000 мкг/м2 после завершения миелосупрессивной терапии.
Мобилизация гемопоэтическими ростовыми факторами
Г-КСФ наиболее часто применяется в дозе 10 мкг/кг/сут. Как показали исследования, увеличение дозы препарата не приводит к усилению мобилизационного эффекта, причем минимальная доза не определена. После 4-5 дней лечения Г-КСФ уровень СКК повышается в 40-80 раз. Впервые влияние Г-КСФ при мобилизации СКК у больных с немиелоидной патологией описали Sheridan et al. [43] (доза 12 мкг/кг/сут б дней, лейкаферез был выполнен в дни 5, б и 7-й). Уровень КОЕ-ГМ в периферической крови в среднем возрастал в 58 раз. Basser et al. сообщили о результатах мобилизации СКК с помощью Г-КСФ у больных, ранее не получавших химиотерапевтических препаратов. Было показано, что количество СКК при этом примерно в 10 раз больше, чем после XT.
При аллогенной трансплантации использование Г-КСФ является общепринятым. Наиболее распространенная доза - 10 мкг/кг/сут с проведением лейкафереза после 4-5 дней мобилизации. Как правило, одной процедуры достаточно для сбора необходимого количества СКК.
Фактор стволовой клетки имеет умеренную мобилизационную активность, однако обладает выраженным синергизмом и, как правило, применяется в комбинации с другими ГРФ. Было показано, что у больных с прогностически неблагоприятными формами рака молочной железы сочетание СФ и Г-СКФ позволяет собрать на 70% КОЕ-ГМ больше, чем монотерапия Г-КСФ. Кроме того, при мобилизации одним Г-КСФ уровень КОЕ-ГМ возвращается к нормальному в течение суток после отмены препарата, а при совместном использовании СФ и Г-СКФ сохраняется повышенным еще в течение 5 дней после прекращения стимуляции. Назначение СФ в качестве второго ГРФ позволяет усилить мобилизационное действие после ранее проведенной XT.
Имеется ряд сообщений об эффективности ГМ-КСФ при мобилизации СКК. Большинство авторов признает, что ГМ-КСФ уступает по активности Г-КСФ, вследствие чего последний применяется чаще.
ИЛ-3 обладает малым мобилизационным потенциалом и назначается только в сочетании с другими ГРФ, например, Г-КСФ или ГМ-КСФ. Однако убедительных результатов о преимуществах режимов с включением ИЛ-3 не получено.
Имеются отдельные сообщения о применении PIXY321 в дозе от 500 до 1000 мкг/м2/сут в течение 14 дней, свидетельствующие об умеренном 3-10-кратном повышении концентрации миелоидных и эритроидных КОЕ в периферической крови.
В настоящее время в экспериментах на животных изучается мобилизационная активность Flt3 лиганда, MIP-1a (macrophage inflammatory protein-1a), эритропоэтина, ИЛ-6, -8, -2.
Факторы, определяющие сбор ГСК
Показано, что на количество СКК влияет доза химиопрепаратов, выраженность миелосупрессии, скорость восстановления уровня лейкоцитов в периферической крови, назначение Г-КСФ или ГМ-КСФ. Существенное воздействие на эффективность мобилизации оказывает степень поражения КМ. Имеют значение такие факторы, как длительность предшествующей XT, проведение широкопольной радиотерапии, интервал между окончанием XT и мобилизацией, применение токсичных для стволовых клеток препаратов, таких как кармустин и мелфалан.
Вышеназванные показатели можно использовать для оценки возможного резерва гемопоэза пациента. По данным Fruehauf et at., наличие в периферической крови >0,4х106/л СD34+-клеток до мобилизации предполагает 95%-ю вероятность их сбора в достаточной для трансплантации дозе.
Техника коллекции СКК
После химиотерапевтической мобилизации аферез СКК начинают, как правило, при количестве лейкоцитов 1х109/л и более и продолжают до уровня 3x108 мононуклеарных клеток/кг веса реципиента. Более точной является ориентация на содержание СD34+-клеток в периферической крови; большинство клиницистов начинает коллекцию СКК при уровне 20-40х106/л. Если мобилизация осуществляется только Г-КСФ, аферез обычно производят на 5, б, 7-й день после его назначения. Уровень предшественников кроветворения в периферической крови снижается после 8-го дня, несмотря на продолжающееся введение Г-КСФ, что делает дальнейший аферез неэффективным. Если мобилизационный режим включает XT и ГРФ, аферез, как правило, начинают после достижения уровня лейкоцитов 2-5х109/л, однако многие клиницисты производят данную процедуру при показателе более 10х109/л.
При стандартном лейкаферезе процессируется 8-10 л крови со скоростью от 20 до 80 мл/мин, при этом он занимает около 4 часов. Для сбора 7х108/л мононуклеарных клеток требуется от 7 до 17 аферезов. В последние годы внимание исследователей привлекла возможность получения необходимого для трансплантации количества СКК путем однократного афереза. Методически это выполняется посредством большеобъемного высокоскоростного лейкафереза (БОЛФ), при котором процессируется 15-20 л крови со скоростью 100-120 мл/мин. Такой метод имеет преимущество перед стандартным не только по скорости сбора СКК. При процессировании равных объемов крови при БОЛФ удается получить большее количество предшественников кроветворения.
Типы клеток для мобилизации
Подсчет числа СD34+-клеток как показателя гемопоэтического потенциала трансплантата впервые предложили Siena et al. В последующем этот метод стал широко применяться при сборе СКК, хотя до сих пор остаются сомнения в его информативности. Так, Bender et al. дополнительно определяли экспрессию миелоид¬ных (CD33) и лимфоидных (CD19, CD7) антигенов и рецептор трансферина (CD71). Авторы сообщили, что мобилизованные циклофосфамидом СD34+-клетки отличны от костно-мозговых по двум аспектам: в первых выявлен очень низкий процент преВ-лимфоцитов и невысокий уровень экспрессии CD71; кроме того, индивидуально были собраны неодинаковые субпопуляции СD34+-клеток. Hohaus et al. также была установлена выраженная гетерогенность коэкспрессии антигенов CD33 и CD71 у различных больных.
В дальнейшем было установлено, что пропорция CD34+Thy-1-клеток зависит от дня афереза. Наиболее высокий уровень приходится на первую процедуру, затем он прогрессивно снижается в последующие дни коллекции. Эти данные крайне важны при аллогенной трансплантации, где число СD34+Тhу-1+Lin-клеток может определить длительность эффективного гемопоэза. В исследованиях, посвященных изучению в мобилизованных клетках экспрессии САМ и пролиферативного потенциала, было показано, что СD34+-клетки отличаются от костно-мозговых по данным параметрам.
Sutherland et al. выявили, что содержание в крови наиболее примитивных предшественников гемопоэза LTC-IC (long-term culture-initiating cells) не коррелирует с уровнем КОЕ-ГМ и СD34+-клеток и скоростью восстановления гемопоэза после трансплантации. Они же продемонстрировали, что пролиферативный потенциал мобилизованных LTC-IC значительно ниже такового костно-мозговых клеток.
В собранном лейкоконцентрате содержится большое число зрелых Т-клеток и Т-лимфоидных предшественников, что обуславливает быструю иммунологическую реконституцию после аутологичной трансплантации. Кроме того, в мобилизованных клетках крови значительно выше, чем в КМ, уровень моноцитов и натуральных киллеров (NK). Мононуклеары, собранные в период регенерации гемопоэза, секретируют большее количество цитокинов, чем в обычных условиях. Показано влияние ИЛ-6,-8 и Г-КСФ на скорость восстановления уровня нейтрофилов в раннем посттрансплантационном периоде. Иммунная активность донорских лейкоцитов способствует развитию такой реакции, как трансплантат-против-лейкемии, а при аутологичной трансплантации может использоваться для иммунотерапии.
Клеточная доза трансплантата
Количество предшественников - важный показатель лейкафереза, так как от него зависит восстановление гемопоэза после трансплантации. Если при сборе КМ достаточно знать только уровень ядросодержащих клеток, при мобилизации СКК подсчитывают число предшественников кроветворения.
Определение количества ГМ-КСФ в собранном лейкоконцентрате было впервые предложено в 1986 г.; необходимый для восста¬новления гемопоэза уровень - 30-50х104/кг веса реципиента. Последующие исследования подтвердили, что менее 20х104/кг значительно уменьшает скорость регенерации гемопоэза после трансплантации. В настоящее время минимальной дозой трансплантируемых СКК считается по ГМ-КСФ 15-20х104/кг, а по CD34+ -1-2х106/кг веса реципиента. Более высокий уровень способствует более быстрому восстановлению кроветворения, однако доза по CD34+ более 8х106/кг не ускоряет регенерацию гемопоэза после трансплантации по сравнению с 5-8х106/кг.
У больных острым миелобластным лейкозом было отмечено неожиданное снижение содержания тромбоцитов менее 20х109/л через 2 месяца после трансплантации, что не было связано с клеточной дозой и встречалось даже при уровне по ГМ-КСФ более 100х104/кг.
Tricot et al. проанализировали данные по минимально достаточной клеточной дозе по CD34+ при миеломной болезни в зависимости от предшествующей терапии. Было показано, что при длительности противоопухолевого лечения до 24 месяцев дос¬таточный для восстановления гемопоэза уровень СD34+-клеток составляет 2х106/кг, но при продолжительности более 24 месяцев доза трансплантата должна быть более 5х106/кг. Авторы предполагают, что цитостатическая терапия оказывает влияние на качество СD34+-клеток либо повреждает строму КМ, что ухудшает приживаемость трансплантата.
Является ли аферез необходимым?
Аферез СКК доставляет определенный дискомфорт больному или донору, а в некоторых случаях, например, при тромбоцитопении, он может быть противопоказан. В настоящее время разрабатываются способы экспансии СD34+-клеток ex vivo с целью достижения регенерации гемопоэза. Следует отметить, что при достаточном содержании кроветворных предшественников в периферической крови аферез не является обязательным. Так, Groot et al. сообщили о восстановлении гемопоэза после аутологичной трансплантации 1000 мл венозной крови, мобилизованной по протоколу IMVP+Г-КСФ. Авторы установили, что скорость восстановления уровня нейтрофилов при этом была на 18% выше, чем после трансплантации КМ.
Перспективы применения стволовых клеток
В 2002 г. Strauer et al. произвели аутологичную трансплантацию мононуклеарных клеток КМ через интракоронарный катетер в зону инфаркта миокарда у 10 больных. Спустя 3 месяца размер очага поражения достоверно уменьшился, а функция миокарда улучшилась по сравнению с контрольными данными. В другом исследовании продемонстрировано, что в раннем постинфарктном периоде в крови увеличивается уровень СD34+-клеток. Авторы связывают данный факт с тем, что СD34+-мононуклеары являются предикторами эндотелиальных предшественников, появление которых в циркулирующей крови способствует реваскуляризации пораженной зоны.
Kuehnle et al. сообщают об экспериментах по восстановлению поврежденной ткани скелетной мускулатуры, миокарда, печени, эндотелия, головного мозга при трансплантации костномозговых клеток в общий кровоток или непосредственно в патологический очаг.
Таким образом, стволовые клетки находят все более широкое применение и в других областях медицины. Поэтому крайне актуальными являются дальнейшие исследования, посвященные изучению их биологии и клинической эффективности.
Литература
1. То LB, Haylock ON, Dowse T, Simmons PJ, Trimboli S, Ashman LK, Juttner CA: A comparative study of the phenotype and proliferative capacity of peripheral blood(PB) CD34/ cells mobilized by four different protocols and those of steady-phase PB and bone marrow CD34/ cells. Blood 84:2930,1994
2. Simmons PJ, Leavesley DI, Levesque J-P, Swart BW, Haylock ON, To LB, Ashman LK, Juttner CA: The mobilization of primitive hemopoietic progenitors into the peripheral blood. Polyfunctionolity of hemopoietic regulators: The Metaclf Forum. Stem Cells 12:187, 1994 (suppl 1)
3. Bender JG, To LB, Williams S, Schwartzberg LS: Defining a therapeutic dose of peripheral blood stem cells. J Hematother 1:329,1992
4. To LB, Roberts MM, Rawling CM, Dyson PG, Rowling TP, Haylock DN, Juttner CA:Establishment of a clinical threshold cell dose: Correlation between CFU-GM and duration of aplasia, in Wunder E, Sovalat H, Henon PR, Serke S (eds): HematopoieticStem Cells: The Mulhouse Manual. Dayton, OH, AlphaMed, 1994, p 15
5. Sutherland DR, Keating A, Nayar R, Anonia S, Stewart AK: Sensitive detection and enumeration of CD34/ cells in peripheral and cord blood by flow cytometry. Exp Hematol 22:1003,1994
6. Micklem HS, Anderson N, Ross R: Limited potential of circulating hemopoietic stem cells. Nature 256:41, 1975
7. McCredie KB, Hersh EM, Freireich EJ: Cells capable colony formation in the peripheral blood of man. Science 171:293,1971
8. Jehn U, Kern K, Wachholz K, Holzel D: Prognostic value of in vitro growth pattern of colony forming cells in adult acute leukaemia. Br J Cancer 47:423, 1983
9. Hibben JA, Njoku OS, Matutes F, Lewis SM, Goldman JM: Myeloid progenitor cells in the circulation of patients with myelofibrosis and other myeloproliferative disorders. Br J Haematol 57:495,1984
10. Hershko C, Ho WG, Gale RP, Cline MJ: Cure of aplastic anaemia in paroxysmal nocturnal hemoglobulinuria by marrow transfusion from identical twin: Failure of peripheral leucocyte trans-fusion to correct marrow aplasia. Lancet 1:945,1979
11. Abrams RA, Glaubiger D, Appelbaum FR, Deisseroth AB: Result of attempted hematopoietic reconstitution using isologous, peripheral blood mononuclear cells: A Case Report. Blood 56:516, 1980
12. Kessinger A, Armitage JO, Landmark JD, Smith DM, Weisenburger DD: Reconstitution of human hematopoietic function with autologous cryopreserved circulating stem cells. Exp Haematoll4:192,1986
13. Kessinger A, Armitage JO, Landmark JD, Smith DM, Weisenburger DD: Autologous peripheral hematopoietic stem celltransplantation restores hematopoietic function following marrow/ablative therapy. Blood 71:723,1988
14. Cline MJ, Golds DW: Mobilization of hematopoietic stem cells (CFU-C) into the peripheral blood of man by endotoxin. Exp Hematol 5:186,1977
15. Barrett AJ, Longhurst P, Sneath P, Watson JC: Mobilization of CFU-C by exercise and ACTH induced stress in man. Exp Hema tol 6:590,1978
16. Molineux G, Pojda Z, Hampson IN, Lord BI, Dexter TM: Transplantation potential of peripheral blood stem cells induced by granulocyte colony-stimulating factor. Blood 76:2153, 1990
17. Neben S, Marous K, Minch P: Mobilization of hematopoietic stem and progenitor cell populations from marrow to the blood of mice following cyclophosphamide and/or granulocyte colony-stimulating factor. Blood 81:1960,1993
18. Yan X-Q, Hartley С McElroy P, Chang A, McCrea, McNiece I: Peripheral blood progenitor cells mobilized by recombinant human granulocyte colony-stimulating factor plus recombinant rat stem cell factor contain long-term engrafting cells capable of cellular proliferation for more than two years as shown by serial transplantation in mice. Blood 85:2303,1995
19. Tavassoli M, Hardy CL: Molecular basis of homing of intra-venously transplanted stem cells. Blood 76:1059,1990
20. Gordon MY: Haemopoietic progenitor cell binding to the stromal environment in vitro. Exp Hematol 18:837,1990
21. Long MW: Blood cell cytoadhesion molecules. Exp Hematol 20:288, 1992
22. Simmons PJ, Zannettino A, Gronthos S, Leavesley D: Potential adhesion mechanisms for localisation of haemopoietic progenitors to bone marrow stroma. Leuk Lymphoma 12:353, 1994
23. Tsai S: Differential binding of erythroid and myeloid progenitors to fibroblasts and fibronectin. Blood 69:1587,1987
24. Simmons PJ, Masinovsky B, Longenecker BM, Berenson R, Torok-Storb B, Gallatin WM: Vascular cell adhesion molecule-1 expressed by bone marrow stromal cells mediotes the binding of hematopoietic progenitors. Blood 80:388,1992
25. Williams DA, Rios M, Stephens C, Patel VP: Fibronectin and VLA-4 in haemopoietic stem cell-microenvironment. Nature 352,1991
26. Jacobson К Kravitz J, Kincade PW, Osmond DG: Adhesion receptors on bone marrow stromal cells: In vivo expression of vascular cell adhesion molecule-1 by reticular cells and sinusoidal endothelium in normal and g-irridiated mice. Blood 87:73,1996
27. Papayannopoulou T, Nakamoto B: Peripheralisation of hemo-poietic progenitors in primates treated with anti-VLA-4 integrin. Proc Natl Acad Sci USA 90:9374,1993
28. Mohle R, Haas R, Hunstein W: Expression of adhesion molecules and c-kit on CD34/ hematopoietic progenitor cells: Comparison cytokine mobilised blood stem a normal bone marrow and peripheral blood. J Hematother 2:483,1993
29. Derskson MW, Gerritsen WR, Rodenhuis S, Dirkson MKA, Slaper-Contenboch CM, Schaasberg W, Pinedo HM, von dem Borne AEGK, van der Schoot CE: Expression of adhesion molecules on CD34/ cells: CD34/ L-selectin/ cells predict a rapid platelet recovery after peripheral blood stem cell transplantation. Blood 85:3313, 1995
30. Kovach NL, Lin N, Yednock T, Harlan JM, Broudy VC: Stem cell factor modulates activity of a4b1 and a5b1 integrins expressed on hematopoietic cell lines. Blood 85:59.1995
31. Levesque J-P, Leavesley DI, Niutta S, Vadas M, Simmons PJ: Cytokines increase human hemopoietic cell adhesiveness by activation of very late antigen (VLA)-4 and VLA-5 integrins. J Exp Med 1805,1995
32. Levesque J-P, Haylock DN, Simmons PJ: Cytokine regulation of proliferation and cell adhesion are correlated events in human CD34/ hemopoietic progenitors. Blood 88:1168,1996
33. To LB, Rowling C, Andary C, Rowling T, Haylock A, Thorp D, Dyson P, Juttner CA: The efficacy of sequential/combined IL-3/ GM-CSF administration in peripheral blood (PB) progenitor mobilization, Blood 82:319a, 1993 (abstr, suppl 1)
34. Reiffers J, Bernard P, David B, Vezon G, Sarrat A, Marit G, Moulinier J, Brous:e: -Successful autologous transplantation with peripheral blood hemopoietic cells in patient with acute leukaemia. Exp Hematol 14:312,1986
35. Korbling M, Darken B, Ho AD, Pezzuto A, Hunstein W, Fliedner TM: Autologous transplantation of blood derived hemopoietic stem cells after myeloablative therapy in a patient with Burkett's lymphoma. Blood 67:629,1986
36. Rowlings PA, Rowling CA, To LB, Bayly JL, Juttner CA: A comparison of peripheral blood stem cell mobilization after chemotherapy with cyclophosphamide as a single agent in doses of 4 g/m in patients with advanced cancer. Aust NZ J Med 22:600. 1992
37. Kotasek DD, Shepherd KM, Sage RE, Date BM, Norman JE, Charles P, Gregg CA. Pillow A, Bolton A: Factors affecting blood stem cell collections following high dose cyclophosphamide mobilization in lymphoma, myeloma and solid tumors. Bone Marrow Transplant 9:11,1992
38. Jagannath S, Vesole DH, Glenn L, Crowley J, Bartogie B: Low risk intensive therapy for multiple myeloma with combined autologous bone marrow and blood stem cell support. Blood 80:1666,1992
39. Schwartzberg LS: Peripheral blood stem cell mobilization in the out-patient setting in Wunder EW, Henon PR (eds): Peripheral Blood Stem Cell Autografts. Heidelberg. Germany, Springer-Verlag, 1993, p 177.
40. Haynes A, Hunter A, McQuaker G, Anderson S, Bienz N, Russell NH: Engraftment characteristics of peripheral blood stemcells mobilised with cyclophosphamide and the delayed addition of G-CSF. Bone Marrow Transplant 16:359,1995
Тем не менее все еще остается много неясных вопросов, касающихся их биологии и клинического использования. Механизм мобилизации гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) до сих пор неизвестен, вследствие чего дизайн мобилизационных протоколов является эмпирическим [1, 2]. Не определено влияние количественного и качественного состава клеток на восстановление гемопоэза после трансплантации СКК [3, 4, 5]. Все это вызывает необходимость проведения дальнейших исследований в этой области.
Ранее существовало положение о преимуществе КМ в качестве источника ГСК [6]. У человека в постнатальный период при обычных условиях в периферической крови содержится небольшое количество ГСК, их уровень возрастает при миелопролиферативных заболеваниях [7, 8, 9]. Первые попытки клинического применения немобилизованных клеток крови в качестве источника регенерации гемопоэза в конце 70-х гг. были неудачными [10, 11]. Более поздние работы также не выявили преимуществ в скорости восстановления кроветворения по сравнению с КМ [12, 13]. В дальнейшем внимание исследователей было сосредоточено на мобилизованных клетках крови. Было показано, что повышение уровня предшественников гемопоэза в крови может быть вызвано введением декстранов, эндотоксина, адренокортикотропина, а также физическими упражнениями [14, 15]. Благодаря преимуществам мобилизованных клеток крови в восстановлении гемопоэза в настоящее время только они используются с целью трансплантации [16,17,18].
Феномен мобилизации предшественников кроветворения
В настоящее время не вызывает сомнений, что мобилизованные предшественники кроветворения имеют костно-мозговое происхождение. Исходя из этого предполагается, что при мобилизации происходят следующие события: 1) модуляция взаимодействия предшественник - костно-мозговая строма; 2) миграция ГСК из костно-мозговых синусов сквозь базальную мембрану и эндотелиальный слой.
Локализация гемопоэза в КМ предполагает регуляцию адгезивных взаимодействий между примитивными кроветворными предшественниками и стромальным костно-мозговым микроокружением [19, 20, 21, 22]. Примитивные кроветворные предшественники имеют широкий спектр молекул клеточной адгезии (САМ - cell adhesion molecules), включая интегрины, селектины, иммуноглобулины и семейство CD44 адгезивных молекул. Лиганды ко многим САМ экспрессируются костно-мозговыми стромальными клетками [19, 21, 22]. Механизм регуляции взаимодействия между парами САМ - лиганд в КМ до конца не изучен. Однако недавние исследования показали возможную взаимосвязь между β1-интегрином VLA-4 и двумя лигандами - фибронектином и VCAM-1, экспрессируемыми костно-мозговой стромой [23, 24, 25, 26]. Продемонстрировано, что aнтиVLA-4-антитела, нарушая функционирование VLA-4, индуцируют мобилизацию гемопоэтических предшественников. Антитела к β2-интегрину (CD18), который также экспрессируется предшественниками кроветворения, нарушают процесс мобилизации, что доказывает роль VLA-4 в связывании предшественников с КМ [27]. Установлено, что мобилизованные СD34+-клетки демонстрируют редукцию экспрессии определенных САМ, в частности VLA-4, LFA-1, LFA-3, тогда как CD31, CD44, CD62L остаются интактными [28, 29]. Важно отметить, что функциональные сдвиги САМ могут происходить без изменения их поверхностной экспрессии. В обычных условиях зрелые лейкоциты, СD34+-клетки КМ экспрессируют β1-интегрины VLA-4 и VLA-5 в неактивном состоянии [30]. После лечения различными цитокинами, включая интерлейкин-3 (ИЛ-3), гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ), стволовый фактор (СФ), в СD34+-клетках зарегистрировано транзиторное (в пределах 10-15 мин) дозо¬зависимое повышение активности VLA-4 и VLA-5-лигандов [31, 32]. Из других важных результатов следует отметить снижение экспрессии c-kit, чьим лигандом является СФ, в мобилизованных СD34+-клетках периферической крови [1,2]. Механизм, ответствен¬ный за снижение экспрессии c-kit, остается неизвестным.
Полученные к настоящему времени данные позволяют предположить, что мобилизация кроветворных предшественников (возможно, частично) является результатом цитокининдуцированных изменений в функции интегринов на СD34+-клетках, что способствует их выходу из КМ. Факторы, модулирующие миграцию гемопоэтических предшественников из КМ, также не установлены. Хотя механизмы миграции нейтрофилов в ткани хорошо известны, остается неясным, принимают ли они участие в миграции кроветворных предшественников.
Большинство проведенных исследований сфокусировано на оценке свойств предшественников гемопоэза при их мобилизации. Только небольшая часть работ посвящена изучению стромы КМ в период мобилизации. Показано, что ее повреждение в результате предшествующей химиотерапии (XT) может объяснить неудовлетворительный эффект мобилизации [33]. Кроме того, было отмечено, что усиление пролиферации клеток стромы, наблюдаемое у больных, получающих ИЛ-3, может также привести к задержке выхода кроветворных предшественников из КМ [33].
Таким образом, механизмы мобилизации гемопоэтических предшественников из КМ в настоящее время недостаточно изучены. Большему пониманию этой проблемы, по мнению многих авторов, способствует появление данных, полученных в результате применения мобилизационных протоколов.
Протоколы мобилизации кроветворных предшественников.
Миелосупрессивная терапия.
Высокодозный циклофосфамид был первым мобилизационным протоколом, испытанным в клинических условиях [34, 35, 36]. При восстановлении гемопоэза после миелосупрессии в периферической крови было зафиксировано более чем 50-кратное повышение концентрации КОЕ-ГМ (гранулоцитарно-макрофагальной колониеобразующей единицы). Основными осложнениями при данном виде мобилизации являются сепсис и геморрагический синдром. В ряде клинических исследований показано, что при нейтропении после мобилизации сепсис отмечен у 44-100% больных; геморрагический синдром, требующий трансфузии тромбоконцентрата, - у 18%. Летальность в этот период составила 3% [36, 37, 38]. С появлением колониестимулирующих факторов миелосупрессивная мобилизация без них не проводится.
Миелосупрессивная терапия + гемопоэтические ростовые факторы
Применение гемопоэтических ростовых факторов (ГРФ) позволило значительно снизить токсичность и повысить эффективность протокола. В настоящее время с целью мобилизации предшественников кроветворения назначаются Г-КСФ, ГМ-КСФ, ИЛ-3, из которых в режимах миелосупрессии наиболее широко используется Г-КСФ. Среди схем мобилизации, включающих ГРФ, наиболее изучены следующие: высокодозный циклофосфамид (ВДЦ), ВДЦ+этопозид, ВДЦ+цисплатин [39]. Ряд авторов показал, что добавление Г-КСФ к ВДЦ позволяет вдвое увеличить содержание мононуклеаров в собранном лейкоконцентрате и в 4-6 раз повысить уровень СD34+-клеток. Доза Г-КСФ при мобилизации ГСК составляет, как правило, от 3 до б мкг/кг/сут. Однако на практике наиболее часто используют 300 мкг Г-КСФ в сутки. КСФ начинают вводить, как правило, на следующий день после окончания миелосупрессивной терапии. Имеются сообщения о применении Г-КСФ в дозе 300 мкг/сут на + 5 день после завершения курса ВДЦ [40].
ГМ-КСФ имеет мобилизационную активность, сравнимую с таковой Г-КСФ, однако менее распространен из-за побочных действий, главным из которых является лихорадка. Доза препарата составляет от 5 до 250 мкг/кг/сут. Введение ГМ-КСФ с +5 дня после миелосупрессивной терапии также эффективно, как и с +1 дня. Протокол с последовательным назначением ИЛ-3 и ГМ-КСФ позволяет собирать большее количество СКК [41]. Схема введения следующая: ИЛ-3 (дни от 1 до 5-го) и ГМ-КСФ (дни от б до 14-го); оба в дозе 250 мкг/м2/сут.
Как показали рандомизированные исследования, наибольший мобилизационный эффект получен при использовании PIXY321 (ГМ-КСФ/ИЛ-3 объединенный белок) в дозе от 500 до 1000 мкг/м2 после завершения миелосупрессивной терапии.
Мобилизация гемопоэтическими ростовыми факторами
Г-КСФ наиболее часто применяется в дозе 10 мкг/кг/сут. Как показали исследования, увеличение дозы препарата не приводит к усилению мобилизационного эффекта, причем минимальная доза не определена. После 4-5 дней лечения Г-КСФ уровень СКК повышается в 40-80 раз. Впервые влияние Г-КСФ при мобилизации СКК у больных с немиелоидной патологией описали Sheridan et al. [43] (доза 12 мкг/кг/сут б дней, лейкаферез был выполнен в дни 5, б и 7-й). Уровень КОЕ-ГМ в периферической крови в среднем возрастал в 58 раз. Basser et al. сообщили о результатах мобилизации СКК с помощью Г-КСФ у больных, ранее не получавших химиотерапевтических препаратов. Было показано, что количество СКК при этом примерно в 10 раз больше, чем после XT.
При аллогенной трансплантации использование Г-КСФ является общепринятым. Наиболее распространенная доза - 10 мкг/кг/сут с проведением лейкафереза после 4-5 дней мобилизации. Как правило, одной процедуры достаточно для сбора необходимого количества СКК.
Фактор стволовой клетки имеет умеренную мобилизационную активность, однако обладает выраженным синергизмом и, как правило, применяется в комбинации с другими ГРФ. Было показано, что у больных с прогностически неблагоприятными формами рака молочной железы сочетание СФ и Г-СКФ позволяет собрать на 70% КОЕ-ГМ больше, чем монотерапия Г-КСФ. Кроме того, при мобилизации одним Г-КСФ уровень КОЕ-ГМ возвращается к нормальному в течение суток после отмены препарата, а при совместном использовании СФ и Г-СКФ сохраняется повышенным еще в течение 5 дней после прекращения стимуляции. Назначение СФ в качестве второго ГРФ позволяет усилить мобилизационное действие после ранее проведенной XT.
Имеется ряд сообщений об эффективности ГМ-КСФ при мобилизации СКК. Большинство авторов признает, что ГМ-КСФ уступает по активности Г-КСФ, вследствие чего последний применяется чаще.
ИЛ-3 обладает малым мобилизационным потенциалом и назначается только в сочетании с другими ГРФ, например, Г-КСФ или ГМ-КСФ. Однако убедительных результатов о преимуществах режимов с включением ИЛ-3 не получено.
Имеются отдельные сообщения о применении PIXY321 в дозе от 500 до 1000 мкг/м2/сут в течение 14 дней, свидетельствующие об умеренном 3-10-кратном повышении концентрации миелоидных и эритроидных КОЕ в периферической крови.
В настоящее время в экспериментах на животных изучается мобилизационная активность Flt3 лиганда, MIP-1a (macrophage inflammatory protein-1a), эритропоэтина, ИЛ-6, -8, -2.
Факторы, определяющие сбор ГСК
Показано, что на количество СКК влияет доза химиопрепаратов, выраженность миелосупрессии, скорость восстановления уровня лейкоцитов в периферической крови, назначение Г-КСФ или ГМ-КСФ. Существенное воздействие на эффективность мобилизации оказывает степень поражения КМ. Имеют значение такие факторы, как длительность предшествующей XT, проведение широкопольной радиотерапии, интервал между окончанием XT и мобилизацией, применение токсичных для стволовых клеток препаратов, таких как кармустин и мелфалан.
Вышеназванные показатели можно использовать для оценки возможного резерва гемопоэза пациента. По данным Fruehauf et at., наличие в периферической крови >0,4х106/л СD34+-клеток до мобилизации предполагает 95%-ю вероятность их сбора в достаточной для трансплантации дозе.
Техника коллекции СКК
После химиотерапевтической мобилизации аферез СКК начинают, как правило, при количестве лейкоцитов 1х109/л и более и продолжают до уровня 3x108 мононуклеарных клеток/кг веса реципиента. Более точной является ориентация на содержание СD34+-клеток в периферической крови; большинство клиницистов начинает коллекцию СКК при уровне 20-40х106/л. Если мобилизация осуществляется только Г-КСФ, аферез обычно производят на 5, б, 7-й день после его назначения. Уровень предшественников кроветворения в периферической крови снижается после 8-го дня, несмотря на продолжающееся введение Г-КСФ, что делает дальнейший аферез неэффективным. Если мобилизационный режим включает XT и ГРФ, аферез, как правило, начинают после достижения уровня лейкоцитов 2-5х109/л, однако многие клиницисты производят данную процедуру при показателе более 10х109/л.
При стандартном лейкаферезе процессируется 8-10 л крови со скоростью от 20 до 80 мл/мин, при этом он занимает около 4 часов. Для сбора 7х108/л мононуклеарных клеток требуется от 7 до 17 аферезов. В последние годы внимание исследователей привлекла возможность получения необходимого для трансплантации количества СКК путем однократного афереза. Методически это выполняется посредством большеобъемного высокоскоростного лейкафереза (БОЛФ), при котором процессируется 15-20 л крови со скоростью 100-120 мл/мин. Такой метод имеет преимущество перед стандартным не только по скорости сбора СКК. При процессировании равных объемов крови при БОЛФ удается получить большее количество предшественников кроветворения.
Типы клеток для мобилизации
Подсчет числа СD34+-клеток как показателя гемопоэтического потенциала трансплантата впервые предложили Siena et al. В последующем этот метод стал широко применяться при сборе СКК, хотя до сих пор остаются сомнения в его информативности. Так, Bender et al. дополнительно определяли экспрессию миелоид¬ных (CD33) и лимфоидных (CD19, CD7) антигенов и рецептор трансферина (CD71). Авторы сообщили, что мобилизованные циклофосфамидом СD34+-клетки отличны от костно-мозговых по двум аспектам: в первых выявлен очень низкий процент преВ-лимфоцитов и невысокий уровень экспрессии CD71; кроме того, индивидуально были собраны неодинаковые субпопуляции СD34+-клеток. Hohaus et al. также была установлена выраженная гетерогенность коэкспрессии антигенов CD33 и CD71 у различных больных.
В дальнейшем было установлено, что пропорция CD34+Thy-1-клеток зависит от дня афереза. Наиболее высокий уровень приходится на первую процедуру, затем он прогрессивно снижается в последующие дни коллекции. Эти данные крайне важны при аллогенной трансплантации, где число СD34+Тhу-1+Lin-клеток может определить длительность эффективного гемопоэза. В исследованиях, посвященных изучению в мобилизованных клетках экспрессии САМ и пролиферативного потенциала, было показано, что СD34+-клетки отличаются от костно-мозговых по данным параметрам.
Sutherland et al. выявили, что содержание в крови наиболее примитивных предшественников гемопоэза LTC-IC (long-term culture-initiating cells) не коррелирует с уровнем КОЕ-ГМ и СD34+-клеток и скоростью восстановления гемопоэза после трансплантации. Они же продемонстрировали, что пролиферативный потенциал мобилизованных LTC-IC значительно ниже такового костно-мозговых клеток.
В собранном лейкоконцентрате содержится большое число зрелых Т-клеток и Т-лимфоидных предшественников, что обуславливает быструю иммунологическую реконституцию после аутологичной трансплантации. Кроме того, в мобилизованных клетках крови значительно выше, чем в КМ, уровень моноцитов и натуральных киллеров (NK). Мононуклеары, собранные в период регенерации гемопоэза, секретируют большее количество цитокинов, чем в обычных условиях. Показано влияние ИЛ-6,-8 и Г-КСФ на скорость восстановления уровня нейтрофилов в раннем посттрансплантационном периоде. Иммунная активность донорских лейкоцитов способствует развитию такой реакции, как трансплантат-против-лейкемии, а при аутологичной трансплантации может использоваться для иммунотерапии.
Клеточная доза трансплантата
Количество предшественников - важный показатель лейкафереза, так как от него зависит восстановление гемопоэза после трансплантации. Если при сборе КМ достаточно знать только уровень ядросодержащих клеток, при мобилизации СКК подсчитывают число предшественников кроветворения.
Определение количества ГМ-КСФ в собранном лейкоконцентрате было впервые предложено в 1986 г.; необходимый для восста¬новления гемопоэза уровень - 30-50х104/кг веса реципиента. Последующие исследования подтвердили, что менее 20х104/кг значительно уменьшает скорость регенерации гемопоэза после трансплантации. В настоящее время минимальной дозой трансплантируемых СКК считается по ГМ-КСФ 15-20х104/кг, а по CD34+ -1-2х106/кг веса реципиента. Более высокий уровень способствует более быстрому восстановлению кроветворения, однако доза по CD34+ более 8х106/кг не ускоряет регенерацию гемопоэза после трансплантации по сравнению с 5-8х106/кг.
У больных острым миелобластным лейкозом было отмечено неожиданное снижение содержания тромбоцитов менее 20х109/л через 2 месяца после трансплантации, что не было связано с клеточной дозой и встречалось даже при уровне по ГМ-КСФ более 100х104/кг.
Tricot et al. проанализировали данные по минимально достаточной клеточной дозе по CD34+ при миеломной болезни в зависимости от предшествующей терапии. Было показано, что при длительности противоопухолевого лечения до 24 месяцев дос¬таточный для восстановления гемопоэза уровень СD34+-клеток составляет 2х106/кг, но при продолжительности более 24 месяцев доза трансплантата должна быть более 5х106/кг. Авторы предполагают, что цитостатическая терапия оказывает влияние на качество СD34+-клеток либо повреждает строму КМ, что ухудшает приживаемость трансплантата.
Является ли аферез необходимым?
Аферез СКК доставляет определенный дискомфорт больному или донору, а в некоторых случаях, например, при тромбоцитопении, он может быть противопоказан. В настоящее время разрабатываются способы экспансии СD34+-клеток ex vivo с целью достижения регенерации гемопоэза. Следует отметить, что при достаточном содержании кроветворных предшественников в периферической крови аферез не является обязательным. Так, Groot et al. сообщили о восстановлении гемопоэза после аутологичной трансплантации 1000 мл венозной крови, мобилизованной по протоколу IMVP+Г-КСФ. Авторы установили, что скорость восстановления уровня нейтрофилов при этом была на 18% выше, чем после трансплантации КМ.
Перспективы применения стволовых клеток
В 2002 г. Strauer et al. произвели аутологичную трансплантацию мононуклеарных клеток КМ через интракоронарный катетер в зону инфаркта миокарда у 10 больных. Спустя 3 месяца размер очага поражения достоверно уменьшился, а функция миокарда улучшилась по сравнению с контрольными данными. В другом исследовании продемонстрировано, что в раннем постинфарктном периоде в крови увеличивается уровень СD34+-клеток. Авторы связывают данный факт с тем, что СD34+-мононуклеары являются предикторами эндотелиальных предшественников, появление которых в циркулирующей крови способствует реваскуляризации пораженной зоны.
Kuehnle et al. сообщают об экспериментах по восстановлению поврежденной ткани скелетной мускулатуры, миокарда, печени, эндотелия, головного мозга при трансплантации костномозговых клеток в общий кровоток или непосредственно в патологический очаг.
Таким образом, стволовые клетки находят все более широкое применение и в других областях медицины. Поэтому крайне актуальными являются дальнейшие исследования, посвященные изучению их биологии и клинической эффективности.
Литература
1. То LB, Haylock ON, Dowse T, Simmons PJ, Trimboli S, Ashman LK, Juttner CA: A comparative study of the phenotype and proliferative capacity of peripheral blood(PB) CD34/ cells mobilized by four different protocols and those of steady-phase PB and bone marrow CD34/ cells. Blood 84:2930,1994
2. Simmons PJ, Leavesley DI, Levesque J-P, Swart BW, Haylock ON, To LB, Ashman LK, Juttner CA: The mobilization of primitive hemopoietic progenitors into the peripheral blood. Polyfunctionolity of hemopoietic regulators: The Metaclf Forum. Stem Cells 12:187, 1994 (suppl 1)
3. Bender JG, To LB, Williams S, Schwartzberg LS: Defining a therapeutic dose of peripheral blood stem cells. J Hematother 1:329,1992
4. To LB, Roberts MM, Rawling CM, Dyson PG, Rowling TP, Haylock DN, Juttner CA:Establishment of a clinical threshold cell dose: Correlation between CFU-GM and duration of aplasia, in Wunder E, Sovalat H, Henon PR, Serke S (eds): HematopoieticStem Cells: The Mulhouse Manual. Dayton, OH, AlphaMed, 1994, p 15
5. Sutherland DR, Keating A, Nayar R, Anonia S, Stewart AK: Sensitive detection and enumeration of CD34/ cells in peripheral and cord blood by flow cytometry. Exp Hematol 22:1003,1994
6. Micklem HS, Anderson N, Ross R: Limited potential of circulating hemopoietic stem cells. Nature 256:41, 1975
7. McCredie KB, Hersh EM, Freireich EJ: Cells capable colony formation in the peripheral blood of man. Science 171:293,1971
8. Jehn U, Kern K, Wachholz K, Holzel D: Prognostic value of in vitro growth pattern of colony forming cells in adult acute leukaemia. Br J Cancer 47:423, 1983
9. Hibben JA, Njoku OS, Matutes F, Lewis SM, Goldman JM: Myeloid progenitor cells in the circulation of patients with myelofibrosis and other myeloproliferative disorders. Br J Haematol 57:495,1984
10. Hershko C, Ho WG, Gale RP, Cline MJ: Cure of aplastic anaemia in paroxysmal nocturnal hemoglobulinuria by marrow transfusion from identical twin: Failure of peripheral leucocyte trans-fusion to correct marrow aplasia. Lancet 1:945,1979
11. Abrams RA, Glaubiger D, Appelbaum FR, Deisseroth AB: Result of attempted hematopoietic reconstitution using isologous, peripheral blood mononuclear cells: A Case Report. Blood 56:516, 1980
12. Kessinger A, Armitage JO, Landmark JD, Smith DM, Weisenburger DD: Reconstitution of human hematopoietic function with autologous cryopreserved circulating stem cells. Exp Haematoll4:192,1986
13. Kessinger A, Armitage JO, Landmark JD, Smith DM, Weisenburger DD: Autologous peripheral hematopoietic stem celltransplantation restores hematopoietic function following marrow/ablative therapy. Blood 71:723,1988
14. Cline MJ, Golds DW: Mobilization of hematopoietic stem cells (CFU-C) into the peripheral blood of man by endotoxin. Exp Hematol 5:186,1977
15. Barrett AJ, Longhurst P, Sneath P, Watson JC: Mobilization of CFU-C by exercise and ACTH induced stress in man. Exp Hema tol 6:590,1978
16. Molineux G, Pojda Z, Hampson IN, Lord BI, Dexter TM: Transplantation potential of peripheral blood stem cells induced by granulocyte colony-stimulating factor. Blood 76:2153, 1990
17. Neben S, Marous K, Minch P: Mobilization of hematopoietic stem and progenitor cell populations from marrow to the blood of mice following cyclophosphamide and/or granulocyte colony-stimulating factor. Blood 81:1960,1993
18. Yan X-Q, Hartley С McElroy P, Chang A, McCrea, McNiece I: Peripheral blood progenitor cells mobilized by recombinant human granulocyte colony-stimulating factor plus recombinant rat stem cell factor contain long-term engrafting cells capable of cellular proliferation for more than two years as shown by serial transplantation in mice. Blood 85:2303,1995
19. Tavassoli M, Hardy CL: Molecular basis of homing of intra-venously transplanted stem cells. Blood 76:1059,1990
20. Gordon MY: Haemopoietic progenitor cell binding to the stromal environment in vitro. Exp Hematol 18:837,1990
21. Long MW: Blood cell cytoadhesion molecules. Exp Hematol 20:288, 1992
22. Simmons PJ, Zannettino A, Gronthos S, Leavesley D: Potential adhesion mechanisms for localisation of haemopoietic progenitors to bone marrow stroma. Leuk Lymphoma 12:353, 1994
23. Tsai S: Differential binding of erythroid and myeloid progenitors to fibroblasts and fibronectin. Blood 69:1587,1987
24. Simmons PJ, Masinovsky B, Longenecker BM, Berenson R, Torok-Storb B, Gallatin WM: Vascular cell adhesion molecule-1 expressed by bone marrow stromal cells mediotes the binding of hematopoietic progenitors. Blood 80:388,1992
25. Williams DA, Rios M, Stephens C, Patel VP: Fibronectin and VLA-4 in haemopoietic stem cell-microenvironment. Nature 352,1991
26. Jacobson К Kravitz J, Kincade PW, Osmond DG: Adhesion receptors on bone marrow stromal cells: In vivo expression of vascular cell adhesion molecule-1 by reticular cells and sinusoidal endothelium in normal and g-irridiated mice. Blood 87:73,1996
27. Papayannopoulou T, Nakamoto B: Peripheralisation of hemo-poietic progenitors in primates treated with anti-VLA-4 integrin. Proc Natl Acad Sci USA 90:9374,1993
28. Mohle R, Haas R, Hunstein W: Expression of adhesion molecules and c-kit on CD34/ hematopoietic progenitor cells: Comparison cytokine mobilised blood stem a normal bone marrow and peripheral blood. J Hematother 2:483,1993
29. Derskson MW, Gerritsen WR, Rodenhuis S, Dirkson MKA, Slaper-Contenboch CM, Schaasberg W, Pinedo HM, von dem Borne AEGK, van der Schoot CE: Expression of adhesion molecules on CD34/ cells: CD34/ L-selectin/ cells predict a rapid platelet recovery after peripheral blood stem cell transplantation. Blood 85:3313, 1995
30. Kovach NL, Lin N, Yednock T, Harlan JM, Broudy VC: Stem cell factor modulates activity of a4b1 and a5b1 integrins expressed on hematopoietic cell lines. Blood 85:59.1995
31. Levesque J-P, Leavesley DI, Niutta S, Vadas M, Simmons PJ: Cytokines increase human hemopoietic cell adhesiveness by activation of very late antigen (VLA)-4 and VLA-5 integrins. J Exp Med 1805,1995
32. Levesque J-P, Haylock DN, Simmons PJ: Cytokine regulation of proliferation and cell adhesion are correlated events in human CD34/ hemopoietic progenitors. Blood 88:1168,1996
33. To LB, Rowling C, Andary C, Rowling T, Haylock A, Thorp D, Dyson P, Juttner CA: The efficacy of sequential/combined IL-3/ GM-CSF administration in peripheral blood (PB) progenitor mobilization, Blood 82:319a, 1993 (abstr, suppl 1)
34. Reiffers J, Bernard P, David B, Vezon G, Sarrat A, Marit G, Moulinier J, Brous:e: -Successful autologous transplantation with peripheral blood hemopoietic cells in patient with acute leukaemia. Exp Hematol 14:312,1986
35. Korbling M, Darken B, Ho AD, Pezzuto A, Hunstein W, Fliedner TM: Autologous transplantation of blood derived hemopoietic stem cells after myeloablative therapy in a patient with Burkett's lymphoma. Blood 67:629,1986
36. Rowlings PA, Rowling CA, To LB, Bayly JL, Juttner CA: A comparison of peripheral blood stem cell mobilization after chemotherapy with cyclophosphamide as a single agent in doses of 4 g/m in patients with advanced cancer. Aust NZ J Med 22:600. 1992
37. Kotasek DD, Shepherd KM, Sage RE, Date BM, Norman JE, Charles P, Gregg CA. Pillow A, Bolton A: Factors affecting blood stem cell collections following high dose cyclophosphamide mobilization in lymphoma, myeloma and solid tumors. Bone Marrow Transplant 9:11,1992
38. Jagannath S, Vesole DH, Glenn L, Crowley J, Bartogie B: Low risk intensive therapy for multiple myeloma with combined autologous bone marrow and blood stem cell support. Blood 80:1666,1992
39. Schwartzberg LS: Peripheral blood stem cell mobilization in the out-patient setting in Wunder EW, Henon PR (eds): Peripheral Blood Stem Cell Autografts. Heidelberg. Germany, Springer-Verlag, 1993, p 177.
40. Haynes A, Hunter A, McQuaker G, Anderson S, Bienz N, Russell NH: Engraftment characteristics of peripheral blood stemcells mobilised with cyclophosphamide and the delayed addition of G-CSF. Bone Marrow Transplant 16:359,1995
